液相色譜儀方法開發(fā)

方法開發(fā)的總體目標(biāo)是在盡可能短的時(shí)間內(nèi)優(yōu)化目標(biāo)物的分離度，首先我們先了解一下分離度的計(jì)算公式：

圖一：分離度計(jì)算公式

分離度代表色譜柱分離目標(biāo)峰的能力，因此分離度越高，兩峰之間越容易得到基線分離，從圖一的分離度方程可以看出分離度與柱效、選擇性和保留值相關(guān)。可以通過改善這些因素來提高分離度。

圖二：分離度與選擇性、柱效和保留值間的關(guān)系

從圖二中可以看到影響分離度的因素在分離過程中均有不同的作用，然而選擇性對分離度的影響最大也是最直接的。我們可以通過改變色譜柱的鍵合相或者改變流動(dòng)相這兩種方式對分離度產(chǎn)生影響。

典型的方法開發(fā)流程包括以下步驟：

1. 選擇分離模式

2. 選擇色譜柱和填料規(guī)格

3. 選擇固定相填料

4. 選擇流動(dòng)相溶劑

5. 如果分離模式需要，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH

6. 進(jìn)行等度或梯度初步實(shí)驗(yàn)，以確定邊界條件

7. 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件

反相色譜是目前為止最通用的HPLC的分析方法，大約占所有方法的60% ，將近95%的色譜工作者都在使用。所以分離模式上面我們首要選擇反相色譜模式，其次色譜柱和填料方面我們可以選擇最常用的C18色譜柱，根據(jù)目標(biāo)分析物的分子量選擇相應(yīng)的填料孔徑。一般分子量在2000以下的小分子采用的填料孔徑在80-120Å。雖然同樣都叫C18色譜柱，但由于各個(gè)廠家的生產(chǎn)工藝不同，我們還需要考慮色譜柱的含碳量、比表面積、鍵合密度以及是否封尾等因素。如仍然不能達(dá)到分離效果可以選擇不同固定相的色譜柱填料，比如C8、C4、苯基柱、氰基柱、五氟苯基柱等。

流動(dòng)相中有機(jī)溶劑一般采用乙腈或甲醇，同時(shí)我們建議一定要使用色譜級(jí)以上的溶劑和改性劑。在反向色譜中，流動(dòng)相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開發(fā)對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型樣品的保留隨pH改變而明顯變化。在這類反相系統(tǒng)中，控制pH對于保留和選擇性的穩(wěn)定非常重要。通常在pH2到4條件下，保留時(shí)間對pH的微小改變穩(wěn)定性最高。因此建議將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH。

酸性樣品在酸性條件

· pH<Pka-2

分析形式存在，反相條件下更高保留，保留時(shí)間穩(wěn)定，無次級(jí)作用力；

· pH=Pka

分析形式和離子形式共存，峰容易分叉或者拖尾，較強(qiáng)的次級(jí)作用力，保留不穩(wěn)定；

· pH>Pka-2

離子形式存在，保留較弱，較強(qiáng)的次級(jí)作用力

堿性樣品在堿性條件

· pH>Pka-2

分析形式存在，反相條件下更高保留，保留時(shí)間穩(wěn)定；

· pH=Pka

分析形式和離子形式共存，峰容易分叉或者拖尾，較強(qiáng)的次級(jí)作用力，保留不穩(wěn)定；

· pH<Pka-2

離子形式存在，保留較弱，較強(qiáng)的次級(jí)作用力

從上圖中可以看出流動(dòng)相的pH對色譜分離的影響有多種方式。根據(jù)您所分析的化合物pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是中性化合物，pH對分離度和保留的影響一般是不明顯的。

在確定了色譜柱規(guī)格、合適的固定相柱填料、流動(dòng)相溶劑和改性劑后，即可開始優(yōu)化方法。方法的優(yōu)化是根據(jù)最終目標(biāo)決定的。如果目標(biāo)是得到高分離度，節(jié)省分析時(shí)間并不是首要問題，可以選擇長柱是所有組分都得到最大分離度。如果分離速度很重要，則應(yīng)使用短柱和高流速。對于含許多目標(biāo)化合物的復(fù)雜樣品，需要優(yōu)化梯度方法等。

END

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