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液相色譜儀方法開發(fā)

方法開發(fā)的總體目標(biāo)是在盡可能短的時(shí)間內(nèi)優(yōu)化目標(biāo)物的分離度,首先我們先了解一下分離度的計(jì)算公式:


圖一:分離度計(jì)算公式
分離度代表色譜柱分離目標(biāo)峰的能力,因此分離度越高,兩峰之間越容易得到基線分離,從圖一的分離度方程可以看出分離度與柱效、選擇性和保留值相關(guān)。可以通過改善這些因素來提高分離度。
圖二:分離度與選擇性、柱效和保留值間的關(guān)系
從圖二中可以看到影響分離度的因素在分離過程中均有不同的作用,然而選擇性對分離度的影響最大也是最直接的。我們可以通過改變色譜柱的鍵合相或者改變流動(dòng)相這兩種方式對分離度產(chǎn)生影響。
典型的方法開發(fā)流程包括以下步驟:
1. 選擇分離模式
2. 選擇色譜柱和填料規(guī)格
3. 選擇固定相填料
4. 選擇流動(dòng)相溶劑
5. 如果分離模式需要,調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH
6. 進(jìn)行等度或梯度初步實(shí)驗(yàn),以確定邊界條件
7. 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件
反相色譜是目前為止最通用的HPLC的分析方法,大約占所有方法的60% ,將近95%的色譜工作者都在使用。所以分離模式上面我們首要選擇反相色譜模式,其次色譜柱和填料方面我們可以選擇最常用的C18色譜柱,根據(jù)目標(biāo)分析物的分子量選擇相應(yīng)的填料孔徑。一般分子量在2000以下的小分子采用的填料孔徑在80-120Å。雖然同樣都叫C18色譜柱,但由于各個(gè)廠家的生產(chǎn)工藝不同,我們還需要考慮色譜柱的含碳量、比表面積、鍵合密度以及是否封尾等因素。如仍然不能達(dá)到分離效果可以選擇不同固定相的色譜柱填料,比如C8、C4、苯基柱、氰基柱、五氟苯基柱等。
流動(dòng)相中有機(jī)溶劑一般采用乙腈或甲醇,同時(shí)我們建議一定要使用色譜級(jí)以上的溶劑和改性劑。反向色譜中,流動(dòng)相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開發(fā)對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物,典型樣品的保留隨pH改變而明顯變化。在這類反相系統(tǒng)中,控制pH對于保留和選擇性的穩(wěn)定非常重要。通常在pH2到4條件下,保留時(shí)間對pH的微小改變穩(wěn)定性最高。因此建議將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH。
酸性樣品在酸性條件
· pH<Pka-2
分析形式存在,反相條件下更高保留,保留時(shí)間穩(wěn)定,無次級(jí)作用力;
· pH=Pka
分析形式和離子形式共存,峰容易分叉或者拖尾,較強(qiáng)的次級(jí)作用力,保留不穩(wěn)定;
· pH>Pka-2
離子形式存在,保留較弱,較強(qiáng)的次級(jí)作用力
堿性樣品在堿性條件
· pH>Pka-2
分析形式存在,反相條件下更高保留,保留時(shí)間穩(wěn)定;
· pH=Pka
分析形式和離子形式共存,峰容易分叉或者拖尾,較強(qiáng)的次級(jí)作用力,保留不穩(wěn)定;
· pH<Pka-2
離子形式存在,保留較弱,較強(qiáng)的次級(jí)作用力



從上圖中可以看出流動(dòng)相的pH對色譜分離的影響有多種方式。根據(jù)您所分析的化合物pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是中性化合物,pH對分離度和保留的影響一般是不明顯的。
在確定了色譜柱規(guī)格、合適的固定相柱填料、流動(dòng)相溶劑和改性劑后,即可開始優(yōu)化方法。方法的優(yōu)化是根據(jù)最終目標(biāo)決定的。如果目標(biāo)是得到高分離度,節(jié)省分析時(shí)間并不是首要問題,可以選擇長柱是所有組分都得到最大分離度。如果分離速度很重要,則應(yīng)使用短柱和高流速。對于含許多目標(biāo)化合物的復(fù)雜樣品,需要優(yōu)化梯度方法等。
END




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